新型荧光蛋白与重组FLAG标签的融合表达纯化及与抗FLAG单克隆抗体M2亲和常数测定

论文发布时间：[2009-11-03] 范文大全编辑：Voive.net

所有作者：易科孙婷婷朱聪高晓莲

作者单位：浙江理工大学生命科学学院

论文摘要：通过微流体芯片技术与合成生物学方法合成新型荧光蛋白基因，从中筛选出５个新型荧光蛋白，集中对其中一个绿色荧光蛋白（G２）和一个红色荧光蛋白（H１０）进行性质鉴定。应用亲和层析法（Ni２+-IDA)和快速蛋白液相色谱(FPLC)进行纯化，检测新型荧光蛋白的光谱学性质，质谱分析其分子量。结果显示，它们在大肠杆菌BL２１均能顺利表达，快速成熟，具有成熟速率快、荧光强度强和发射波长更长的优点。以FLAG标签的原始序列DYKDDDDK（FLAG４）为模板，设计４种新FLAG标签FLAG１（DYKDYKYK）， FLAG２（DYKGGGYK）， FLAG３（DYKDYKDYK）和FLAG５（DYKDEDDK)与G２、H１０融合，Western blotting分析表明抗FLAG单克隆抗体M２（AFM２）能够特异性识别G２-FLAG４、G２-FLAG５、H１０-FLAG３、H１０-FLAG４、H１０-FLAG５五种FP-FLAG融合蛋白。采用非竞争性ELISA固相法，计算出FP-FLAG融合蛋白与单克隆抗FLAG M２抗体(AFM２)的亲和常数。AFM２与G２-FLAG４、G２-FLAG５的亲和常数分别为１。６７E+１１、４。６５E+１０，AFM２与H１０-FLAG３、H１０-FLAG４、H１０-FLAG５的亲和常数分别为６。４９E+１０、１。４７E+１１、６。６３E+１０。结果表明FLAG原始序列DYKDDDDK与单抗M２之间的亲和力最高，DYKDEDDK、DYKDYKDYK次之，DYKDYKYK和DYKGGGYK不能与单抗M２特异识别。在FLAG融合蛋白的纯化应用中，运用这些FLAG标签的亲和力差异，在同一纯化体系下通过设计不同的洗提次序和洗提条件，可以达到逐步分离不同目的物的效果，且荧光蛋白本身作为一种标记物，与重组FLAG标签融合形成一个双功能融合蛋白，为今后FLAG融合蛋白的纯化与检测提供了新的思路和理论基础。

关键词：新型荧光蛋白重组FLAG标签非竞争性ELISA 亲和常数双功能融合蛋白

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