所有作者：卢德芬 李曦 杨阳 龚瑶琴
作者单位：山东大学实验畸形学教育部重点实验室、山东大学医学院医学遗传学研究所
论文摘要：目的 在常规胶内酶解方法的基础上，设计一种高效的适用于银染蛋白质凝胶的胶内酶解方法，结合二维电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( MALDI-TOF-MS )使蛋白质鉴定成功率大大提高。方法 通过用一维 SDS-PAGE 分别分离总量为３０ ng、５０ ng和１００ ng 的 BSA（ 牛血清蛋白），银染显色；二维电泳分离 PC１２ 细胞（大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞）可溶性总蛋白，银染显色，得到二维电泳图谱。从得到的一维和二维凝胶上，选取若干目标蛋白条带/点分别采用目前广泛使用的 Andrej Shevchenko 等(２００７)提出的胶内酶解方法（以下简称为A法）和本实验室改进的胶内酶解方法（以下简称为B法）处理，用基质辅助激光解析飞行时间质谱( MALDI-TOF/TOF MS )分析，再通过 Mascot 软件查询 NCBIbovine 和 NCBIrat 数据库，并运用生物信息学鉴定蛋白质。结果 BSA 条带的质谱分析和数据库搜索结果，表明B法在匹配的肽段数、序列覆盖率和蛋白得分值等方面都显著高于A法；PC１２ 细胞总蛋白二维电泳凝胶上选取的点，其质谱分析和数据库搜索结果，提示B法在蛋白质组学研究中有较广的应用范围。结论 与A法相比，B法通过在酶解前，增加５０ mM NH４HCO３ 和５０ mM NH４HCO３/１００％ ACN (１：１，体积比)两步多次洗涤、优化胰酶的量及作用时间和采用酶解肽段的多步抽提等，有效地减少了酶解后肽段的损失，增加了质谱数据库搜索的信息量，从而提高了质谱分析和数据库搜索时的蛋白质检出率。
关键词： 胶内酶解 二维电泳 MALDI-TOF-MS 银染 一维SDS-PAGE 蛋白质组
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